CRISPR-Cas9 – Genteknik för framtiden

I klassisk balett förenas konstnärlig kreativitet och stenhård disciplin. Bakteriologen Emmanuelle Charpentier vet. Hon är skolad i klassisk balett och spelar piano och det är ingen dum bakgrund för en forskare, säger hon. Det är från baletten hon har sin minutiösa noggrannhet och uthållighet genom upprepade ansträngningar. Och, lägger hon till, en forskare behöver odla sin konstnärliga sida, vara kreativ och en smula galen, åtminstone ibland.

Mot den bakgrunden känns det passande att ceremonin för det uppmärksammade amerikanska vetenskapspriset The Breakthrough Prize påminner mer om filmkonstens Oscarsgala än om den strama Nobelprisutdelningen. Tillsammans med forskarkollegan Jennifer Doudna klev Emmanuelle Charpentier upp på scenen för att ta emot Breakthrough Prize 2015 ur Cameron Diaz hand.

En av världens mest inflytelserika

Utdelarna av Breakthrough Prize har inte varit inte ensamma om att vilja uppmärksamma Emmanuelle Charpentier. Samma år hamnade hon på Time Magazines lista över världens 100 mest inflytelserika personer. Och vetenskapliga organisationer och tidskrifter har de senaste åren öst utmärkelser över hennes forskning. Från 2014 och framåt harhon tilldelats en mängd priser, som det schweiziska Prix Louis-Jeantet de médecine, det spanska Premios Princesa de Asturias, det amerikanska Gruber Foundation International Prize in Genetics, norska Kavli Prize, japanska Japan Prize, och tyska Leibniz Prize, Ernst Jung-Preis für Medizin, Carus-Medal och Familie-Hansen-Preis.

År 2015 fick hon även ett jubileumspris från Umeå universitet, där hon då forskat sedan 2009 — Umeå University EC Jubilee Award 2015.

— Jag känner mig hedrad och rörd över dessa prestigefyllda priser. Det är ett stort erkännande för mig och mitt team och även för grundforskningen i mikrobiologi, genetik och biokemi. Priserna visar i vilken omtumlande hastighet vår forskning har använts för biomedicinska och bioteknologiska tillämpningar. Stödet behövs för att övertyga regeringar och anslagsgivare om att grundforskning är avgörande för att undersöka nya mekanismer, som är grunden för forskning efter nya behandlingsstrategier eller bioteknologier.

Används över hela världen

Orsaken till all denna uppståndelse är att Emmanuelle Charpentiers forskning vid Umeå universitet har lagt grunden för en av de största landvinningarna på många år inom genteknik. Upptäckten presenterades 2012 och inbegriper den molekylära mekanismen för ett enzym som har ett namn med visst tuggmotstånd — CRISPR-Cas9. I dag är det svårt att hitta ett hetare begrepp av betydelse för de flesta forskningsfält inom molekylärbiologin. Över hela världen använder forskare CRISPR-Cas9 inom olika områden av biologi och medicin — inte minst för att försöka utveckla strategier för nya behandlingsmetoder mot en rad olika sjukdomar.

Jag känner mig hedrad och rörd över dessa prestigefyllda priser. Priserna visar i vilken omtumlande hastighet vår forskning har använts för biomedicinska och bioteknologiska tillämpningar.

Men låt oss återkomma till det och ta berättelsen från början. Franskfödda Emmanuelle Charpentier är mikrobiolog, biokemist och genetiker — alltså en forskare som med molekylärbiologiska metoder studerar bakterier och deras interaktion med sin värd. Efter forskarutbildning vid ansedda Pasteurinstitutet i Paris och postdoktortjänster vid en rad forskningsmiljöer i USA, däribland The Rockefeller University, blev hon ledare för en egen forskargrupp vid Wiens universitet 2002. Sex år senare erbjöds hon en tjänst som gruppledare vid The Laboratory for Molecular Infection Medicine Sweden — MIMS, Umeå universitet och hon tackade ja.

— Jag var och är fortfarande i dag mycket entusiastisk över MIMS-konceptet vid Umeå universitet. Det fokuserar på utbildning och forskning på hög nivå, med respekt för både hög kvalitet i forskning och mycket insikt i hur man långsiktigt främjar grundforskning och utbildning av doktorander. Konceptet tar också hänsyn till att god forskning behöver tid och goda arbetsvillkor, där alla krafter samlas till en gemenskap. Jag uppskattar mycket att The Nordic EMBL Partnership for Molecular Medicine gav mig den akademiska friheten, som jag behövde.

Konceptet tar också hänsyn till att god forskning behöver tid och goda arbetsvillkor, där alla krafter samlas till en gemenskap.

För att rekrytera de bästa unga forskarna internationellt använder MIMS en framgångsrik strategi efter EMBL:s modell. Modellen innebär att de unga forskarna direkt efter rekryteringen får finansiering för att etablera en egen forskargrupp bestående av 4–5 doktorander och postdocs, samt tillgång till avancerad infrastruktur och utrustning. Denna möjlighet kombineras med mentorskap, unika möjligheter till samarbeten inom det multidisciplinära Umeå Centre for Microbial Research (UCMR) och extern utvärdering där även EMBL medverkar.

Med en säker finansiering genom MIMS kunde Emmanuelle Charpentier starta och fortsätta sina forskningsprojekt och testa nya idéer.

— Under 2008 reste jag fram och tillbaka mellan Österrike och Sverige för att bygga upp mitt labb inom MIMS vid Umeå universitet, säger hon. Dessa resor blev också ett tillfälle för mig att fundera igenom vad jag ville att mitt labb skulle fokusera på de kommande åren: var jag stod i min forskning, vilka forskningsspår jag ville fortsätta med och vilka nya projekt jag ville ta upp. Det var under en sådan resa jag insåg att vi i mitt labb borde inrikta oss mer på de små RNA som har regulatorisk funktion i cellen — i synnerhet en liten RNA-molekyl, som senare blev känd som tracrRNA. Jag beslöt att kartlägga dess eventuella funktion i något som kallas CRISPR.

Blicken har korrigerats

Vid den tiden var CRISPR en angelägenhet främst inom mikrobiologisk forskning och förknippades inte särskilt med genteknik. CRISPR, som står för Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, hör egentligen hemma i bakteriers och arkéers (en annan sorts encelliga organismer) genetik, det vill säga de påvisades i mikroorganismernas DNA. Dessa små DNA-snuttar har varit kända sedan 1980-talet, men länge trodde forskarna att det var en form av ”skräp-DNA” — alltså DNA utan information. Det senaste decenniet har den bilden dock fått korrigeras.

Infektionssjukdomar är fortfarande på andra plats som vanligaste dödsorsak i världen och antibiotikaresistens är ett allt större problem. Därför är det viktigt att vi bättre förstår hur bak­ terierna fungerar och utvecklas.

Kring 2005 började några forskare gissa att CRISPR var en del av bakteriernas försvar mot attack utifrån, och 2007 stod det klart att det faktiskt handlar om ett adaptivt immunförsvar hos bakterier, det vill säga ett försvar med förmåga att anpassa sig, att minnas angripande virus och därmed stå bättre rustade mot framtida attacker. Att bakterier kan ha adaptivt immunförsvar var tidigare okänt. För Charpentier var de nya rönen kolossalt intressanta.

— Målet med forskningen i vårt labb var att förstå ett infektionsförlopp ur bakteriernas perspektiv: hur de överlever, anpassar sig, skyddar sig, förökar sig och orsakar sjukdom, säger hon.

CRISPR handlar om hur bakterier försvarar sig själva mot inkräktare som virus genom att rikta sig mot inkräktarens genom. På så sätt påverkar CRISPR bakteriens förmåga att orsaka sjukdom eller stå emot infektioner.

Började 2009 i Umeå

I början av 2009 började Emmanuelle Charpentier sitt nya jobb som gruppledare vid MIMS vid Umeå universitet. Under de följande åren upptäckte hennes forskargrupp i samarbete med grupper på andra håll i världen mer och mer om detaljerna kring CRISPR-sekvenserna, enzymet och de andra molekylära komponenter som också är involverade i processen. Tillsammans bildar de ett komplex som söker upp och oskadliggör virus-DNA genom att helt enkelt klippa sönder det. Saxen är proteinet Cas9 och den lilla adresslappen som gör att komplexet klipper på rätt ställe utgörs av RNA. Denna RNA kan bakterien producera efter behov — på så sätt anpassar den sitt immunförsvar till att spana efter nya virus.

Snabbt stod det också klart för Emmanuelle Charpentier att CRISPR-Cas9-systemet började likna ett potentiellt verktyg för genmodifiering. Genom att byta ut den lilla RNA-adresslappen borde man kunna få saxen att klippa precis där man vill, i princip var som helst i DNA.

CRISPR-Cas9

Emmanuelle Charpentier och hennes team upptäckte mekanismen för CRISPR-Cas9 i ett adaptivt immunsystem som finns i bakterier och arkéer för att motstå virusattacker. CRISPR-Cas9 består förenklat av följande:

CRISPR-­Cas9 mekanismen hos bakterier. Enzymet Cas9 (saxens blad) behöver båda handtagen, crisprRNA i grönt och tracrRNA i rött, för att känna igen och inaktivera virus DNA vid en ny attack (till höger).

1.  CRISPR DNA-sekvenser (CRISPR står för Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) som är specifika för varje virus och kodar för unika RNA-sekvenser. Denna sekvens är minnet av virus-DNA. En RNA molekyl (handtaget i grönt), som kallas crisprRNA, den innehåller memorerad virala sekvenser som används för att känna igen nya virusattacker.
2. Tillsammans med en annan kort RNA-molekyl, tracrRNA (trans activating crRNA, handtag i rött) vägleder de båda RNA molekylerna enzymet Cas9 (båda blad av saxen) till motsvarande DNA-sekvens.
3.  CRISPR-Cas9 (kompletta saxen) känner igen virus DNA vid en ny virusattack och klipper och neutraliserar inkräktarens DNA för att förebygga en ny infektion. (Publikationer: Nature (2011) 471:602-607, Science (2012) 337:816-821)

Illustration: Linnea Holmström Ljung

 

CRISPR-­Cas9­ systemet (sax) har utvecklats som ett verktyg för genmodifiering i celler hos alla slags levande organismer. Systemet känner igen en exakt gensekvens som ska tas bort eller bytas ut mot en alternativ DNA­ sekvens. Fel gen kan tystas, bytas ut och mutationer kan korrigeras.

Illustration: Linnea Holmström Ljung

— Vi insåg att det borde fungera och att det i så fall skulle kunna bli ett väldigt enkelt och flexibelt verktyg, säger Emmanuelle Charpentier. Man behöver bara designa en ny RNA-sekvens till verktyget, en förhållandevis enkel sak.

Publicerade artikel 2012

Emmanuelle Charpentiers forskargrupp publicerade i augusti 2012 en artikel i tidskriften Science som beskrev hur man på ett målinriktat sätt klipper DNA med CRISPR-Cas9. Sedan har det gått undan. I en snabb följd har det nya verktyget använts och utvecklats inom ett flertal forskningsområden och praktiska sammanhang. Som exempel kan CRISPR inte bara klippa DNA, den kan också användas för att byta ut en gensekvens mot en annan.

— Visst trodde jag att det skulle fungera och jag hade även tidigare förutsagt att systemet kunde utnyttjas för att behandla genetiska sjukdomar hos människan. Jag har alltid genomfört forskning på grundläggande nivå men alltid hållt ett perspektiv mot en eventuell användning av mina upptäckter för den potentiella nyttan som humanläkemedel. Det schweiziska företaget CRISPR Therapeutics, som jag grundat tillsammans med Shaun Foy och Rodger Novak, fokuserar nu på detta område. Plötsligt ville alla vara delaktiga för att kunna testa och använda det nya verktyget. Den nya tekniken blev så snabbt och lätt utnyttjad av forskarvärlden, vilket bekräftar att CRISPR-Cas9 kan användas i så många olika celltyper, även mänskliga celler, konstaterar Emmanuelle Charpentier.

Plötsligt ville alla vara delaktiga för att kunna testa och använda det nya verktyget.

Efter publiceringen i Science i 2012 exploderade intresset bland genforskare och redan under första halvåret 2013 användes CRISPR-Cas9 i laboratorier runt om i världen för att förändra gener hos allt från bakterier, jäst och gröna växter till zebrafiskar, fruktflugor, möss, råttor och mänskliga celler. I augusti 2013 konstaterade tidskriften Science att det rådde ”CRISPR-yra” och vid årets slut kom CRISPR-Cas9 med på ”tio-i-topp listorna” för både Science och Nature över det gångna årets viktigaste vetenskapliga framgångar.

— CRISPR-Cas9 är inte det första verktyget för genteknik, men det är enklare och mångsidigare än de som tidigare utvecklats som så kallade ”Zinc Fingers” och ”TALENs”, förklarar Emmanuelle Charpentier. Skillnaden i mångsidigheten består framför allt i att de gamla teknikerna är beroende av proteiner som adresslappar, medan CRISPR-Cas9:s adresslapp är en RNA-snutt. Att skräddarsy ett nytt protein är en mycket omständligare process än att framställa en RNA-sekvens.

Schweizisk armékniv

CRISPR-Cas9 är som en schweizisk armékniv för genteknik — det har använts i alla typer av levande celler, och det låter sig programmeras för att med precision klippa och klistra i genomet precis där forskarna vill. Det är som om gentekniken fått en motsvarighet till datorernas "Sök & Ersätt"-funktion. Därför har CRISPR-Cas9 redan fått betydelse inom en rad olika forskningsområden, men mest uppmärksammat är dess potential inom medicinen.

— Genom CRISPR-Cas9 skulle man kunna utveckla genterapier för ett mycket stort antal sjukdomar med genetiska orsaker, där det i dag saknas behandling helt, eller där behandlingen skulle kunna bli mycket effektivare, säger Emmanuelle Charpentier. Exempel är blödarsjuka, sickelcellanemi, Pompes sjukdom, Huntingtons sjukdom och cystisk fibros.

Även inom bland annat cancer och allvarliga infektionssjukdomar kan CRISPR-Cas9 möjliggöra utvecklingen av nya behandlingsmetoder. Verktyget används redan i forskning om bland annat HIV och malaria.

Vara försiktig

Men forskning tar tid. Trots det enorma gensvaret i forskarvärlden kommer det att dröja innan det nya verktyget kan användas för medicinsk behandling av människor. Forskarna måste säkerställa att det inte uppstår några betydande ”off target effects”, det vill säga att CRISPR navigerar fel i cellen och manipulerar fel gener.

En möjlig väg för behandling kunde vara att ta ett cellprov från patienten och korrigera den sjukdomsalstrande genen i en cellodling på labbet. Sedan kan de botade cellerna ympas in i patienten på nytt — efter kontroll av att CRISPR-Cas9 utfört jobbet utan missöden.

Emmanuelle Charpentier fick besök av Kung Carl Gustaf XVI i 2015.

BildJohan Gunséus

Förutom nya medicinska behandlingar förutspås den nya tekniken också få stor betydelse för livsmedelsindustrin. Ett annat användningsområde är inom forskning på försöksdjur.

— I dag används ofta så kallade transgena djurmodeller, alltså djur där man gjort vissa genetiska förändringar, säger Charpentier.

– Men att göra dessa förändringar är ofta en tidsödande process. När jag som postdoktor i New York under en period kom i kontakt med djurförsök och tog fram transgena musmodeller, blev jag förundrad över hur mycket tid forskarna behöver ägna åt att förverkliga genetiska förändringar, och hur lite utrymme de i slutändan får för att studera sin djurmodell och dra slutsatser. Med CRISPR kan det detta förändras. Forskare som ligger långt fram är redan igång och använder det.

— CRISPR-Cas9 är på väg att förändra bioteknologin och det medicinska landskapet. Tekniken är mycket mångsidig och flera versioner av CRISPR-Cas9 har nu utvecklats för att påverka gener och deras uttryck på olika sätt. Det finns fortfarande en hel del arbete att göra, men tekniken har en stor potential att omsättas i genläkemedel för behandling av vissa genetiska sjukdomar. Däremot kommer man att behöva vänta ytterligare några år innan läkemedelskandidater gör framsteg i tidiga kliniska tester. Andra framtida utvecklingar handlar om CRISPR-Cas9-teknik för behandling av andra typer av sjukdomar som cancer och infektioner.

Bidrar till ökad kunskap

Forskningen vid MIMS har fokus på molekylära infektionsmekanismer hos olika patogena mikroorganismer. Kunskapen som genereras förväntas också kunna leda fram till utvecklingen av alternativa antimikrobiella strategier. Kunskapen om CRISPR-Cas9 som tagits fram av Emmanuelle Charpentiers forskargrupp kommer sannolikt också bidra till utveckling av alternativa behandlingsmetoder mot infektionssjukdomar och förhindra antibiotikaresistens inom vissa områden.

— Infektionssjukdomar är fortfarande på andra plats som vanligaste dödsorsak i världen och antibiotikaresistens är ett allt större problem. Därför är det viktigt att vi bättre förstår hur bakterierna fungerar och utvecklas. CRISPR-Cas9 kan hjälpa till att öka vår kunskap om de cellulära och molekylära mekanismer som ligger bakom bakterie-, virus- och andra infektionssjukdomar. Och därmed också visa vägen mot nya antimikrobiella behandlingsstrategier. Det pågår redan forskningsprojekt som undersöker möjligheten att CRISPR-Cas9 skulle kunna användas för att behandla infektionssjukdomar.

Väcker etiska frågor

Ett nytt kraftfullt verktyg inom genteknik väcker också både etiska frågor och oro. Hur försäkrar man sig om att genmanipulering inte används på sätt som skadar mänskligheten?

I april 2015 rapporterade kinesiska forskare att de redigerat arvsmassan hos mänskliga embryon med CRISPR-Cas9. Försöken har gjorts på defekta encelliga embryon från en IVF-klinik, vilka aldrig haft förutsättningar att utvecklas till människor, men nyheten har ytterligare aktualiserat diskussionen om genteknikens reglering.

Kunskapen kommer sannolikt också bidra till utveckling av alternativa behandlingsmetoder mot infektionssjukdomar och förhindra antibiotikaresistens inom vissa områden.

Emmanuelle Charpentier tycker att det är bra att etiska frågor får mycket uppmärksamhet. Samtidigt påpekar hon att det sedan länge faktiskt finns fastslagna principer att rätta sig efter, eftersom det varit möjligt att förändra DNA med genteknik i fyra decennier. Dessa regler är lika relevanta för CRISPR-Cas9 som de varit för alla tidigare genteknikverktyg. En grundläggande princip har varit att redigering av det mänskliga genomet inte ska få göras i könsceller, så att förändringen som introduceras för att behandla en individuell patient inte kan föras vidare till kommande generationer.

— Läkemedel bör utvecklas enligt mycket höga säkerhetsstandarder och enbart när det inte finns några lika effektiva eller lättillgängliga behandlingsalternativ till hands. Forskare, läkare, industrin och patienter, inklusive experter på etiska och relaterade juridiska frågor, måste ha en öppen dialog om riskerna och fördelarna med tekniken som möjliggör exakt genförändring i könsceller, förklarar hon.

Fortsatte vara knuten till Umeå

2015 tackade Emmanuelle Charpentier ja till en anställning som vetenskaplig medlem i tyska Max Planck Gesellschaft och som föreståndare för en forskningsavdelning vid Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie i Berlin. Men hon fortsatte länge vara knuten till Umeå som gästprofessor. Till skillnad från många kolleger har Emmanuelle Charpentier varit mån om att inte bara byta miljö utan också forskningsspår då och då under karriären.

— Det är visserligen riskabelt men också väldigt lärorikt att byta ämne, precis som det är stimulerande och en utmaning att flytta mellan länder och forskningsmiljöer. Det har varit viktigt för mig. Det stimulerar till att reflektera, ifrågasätta och hitta rätt angreppssätt för nya frågeställningar, och du tänker ofta friare när du kommer utifrån. Dessutom får man chansen att arbeta med nya kollegor.

- Jag var och är fortfarande idag mycket entusiastisk över MIMS-konceptet vid Umeå universitet. Det fokuserar på utbildning och forskning på hög nivå, med respekt för kvalitet i forskning och mycket instinkt i hur man långsiktigt främjar grundforskning och utbildning av doktorander.

BildHallbauer&Fioretti

Av den anledningen har det varit en fantastisk upplevelse att vara med och etablera ett nytt forskningsfält, förklarar hon. 

— CRISPR har fört samman duktiga forskare från olika områden — bakteriologi, molekylärbiologi, genteknik med mera — och tillsammans utmanas vi att tänka i helt nya banor och utforska det här okända från grunden. Det är oerhört stimulerande att verka i ett så vitalt fält, där det inte hunnit utvecklas några dogmer, och där man verkligen måste vara kreativ.

Hon ser också CRISPR-febern som något av en revansch för mikrobiologi, som annars får en lite undanskymd plats i biologin, i skuggan av högstatusområden som cancerforskning och neurologi.

— Mikrobiologi uppfattas ofta mer som ett lite gammalt fält, där det mesta skulle vara utforskat och klart. I själva verket är det mesta kvar att göra. Infektionssjukdomar är fortfarande den näst vanligaste dödsorsaken i världen och det finns allvarliga farhågor om allt större problem med antibiotikaresistens i framtiden. Därför behöver vi förstå bättre hur bakterier fungerar och utvecklas. Som verktyg för att behandla mänskliga genetiska sjukdomar har CRISPR överbryggat gränser mellan olika delar av biologin och än en gång visat hur viktiga upptäckter kan göras inom mikrobiologi.

Denna artikel publicerades för första gången 2015 och uppdaterades 2019. Sedan dess har Emmanuelle Charpentier tilldelats Nobelpriset i kemi 2020. 

Toppbild: Hallbauer&Fioretti